Genome-wideidentificationandexpressionofYABBYgenesfamilyduringflowerdevelopmentinPunicagranatumL.

全基因组鉴定YABBY基因家族在石榴花发育过程中的表达

Co-InnovationCenterforSustainableForestryinSouthernChina,NanjingForestryUniversity,Nanjing,ChinaCollegeofForestry,NanjingForestryUniversity,Nanjing,China

南京林业大学华南可持续林业联合创新中心，南京

南京林业大学林学院，南京

目的意义

植物特异性YABBY转录因子在植物形态，生长和发育中具有重要的生物学作用。石榴的六个PgYABBY基因分为五个亚家族（YAB1/3，YAB2，INO，CRC和YAB5），基因功能预测和蛋白质网络分析表明，PgYABBY与顶端分生组织，花，心皮和胚珠的发育有关。分析PgYABBY基因的表达显示PgYABBY在花，叶和种皮中被高度激活。其中，PgINO可能在调控花的分化中起关键作用。本文研究了石榴的YABBY基因在两性花和功能性雄性花中发育阶段与花的表达模式的比较，对其功能研究具有潜在的意义。

材料方法

2.1植物材料和数据收集以进行表达分析

图1不同发育阶段的两性花（A）和功能性雄花（B）（P1-P8）。

采样:年4月—6月，bisexualflowersandfunctionalmaleflowers，8个阶段、3组生物学重复；石榴全基因组转录数据——NCBI数据库；拟南芥YABBY蛋白序列—TheArabidopsisInformationSource；西红柿数据—PlantTFDB网站。

2.2YABBY转录因子的鉴定和序列分析

YABBY蛋白序列（PlantTFDB）BLAST比对，HMMER3.0软件包—PfamYABBY结构域HMM分析，CDD网站——验证N端C2C2结构域和C端YABBY结构域的存在，ExPASyProteomicsServer预测理化性质。

2.3系统发育分析、基因结构分析和基序鉴定

Clustalx2.1——石榴、拟南芥和番茄YABBY蛋白进行多序列比对、MEGA7.0——构建系统发育树、GSDS2.0——内含子外显子结构、MEME——基序。

2.4蛋白结构分析和蛋白交互作用网络

Phyre2.0——预测蛋白结构，构建3D蛋白模型、Ensemblplants网站和GOtools——预测蛋白功能、String——蛋白交互作用网络。

2.6预测启动子元件

2.7转录组数据表达模式

Fastp对所有RNA-Seq数据定性处理获得cleanreads，用石榴转录组数据对序列进行索引,通过Kallisto0.44.0软件进一步计算分析基因表达。从而得到YABBY基因相应的表达水平(TPM值)。将TPM值转换为Log2(TPM+1)，最后用R程序编制pheatmap绘制PgYABBY的热图。

2.8通过定量实时PCR（qRT-PCR）的表达模式

总RNA提取—BioTekeplanttotalRNAextractionkit，第一链cDNA合成—reversetranscriptionkit，PgActin内参基因，2?ΔΔCT定量分析。

结果

3.1YABBY转录因子的鉴定和序列分析

3.2系统发育分析

PgYABBY被分为五个不同的组，即YAB1/YAB3，YAB2，INO，CRC和YAB5。其中，YAB1/YAB3组包含两个成员，PgYAB1和PgYAB3分别聚类为YAB1和YAB3组。INO，CRC，YAB2和YAB5的组分别具有一个成员PgINO，PgCRC，PgYAB2和PgYAB5。

图2系统发育进化树

3.3PgYABBYs的基因结构

图3石榴中YABBY基因家族的系统发育树和基因结构。

3.4PgYABBYs的基序

所有PgYABBY成员均包含3至5个外显子的Motif1和Motif2编码的YABBY域。这些结果证明PgYABBY的蛋白质结构域和基序是高度保守的。

图4YABBY家族在石榴中的保守蛋白基序。

3.5蛋白质结构分析和蛋白质相互作用网络

石榴中YABBY家族蛋白的二级结构主要由不规则卷曲，α-螺旋和β-角组成，这些结构遍布这些蛋白。Phyre2预测了PgYABBYs的三级结构。这6种蛋白质代表了YABBY蛋白质的各种构象（图5）。

●PgYAB1、PgYAB3调控胚胎和器官发生过程中细胞远/近极性，调节花器官形成、发育。

●PgYAB5和PgYAB2是近轴细胞的特征基因，调控胚胎顶端分生组织的发育。

●PgINO调节外珠被发育和珠皮的极性生长

●PgCRC调节蜜腺发育，抑制早期雌蕊横向发育，促进心皮融合。

图6石榴中YABBY基因家族的蛋白质-蛋白质相互作用网络。

●PgYAB1和PgYAB3相似，PgYAB1和PgYAB3与KAN、WUS和SPL蛋白相互作用，在第一和第二周期调控花器官的分化。

●PgYAB5和PgYAB2相似

●PgINO和PgCRC在蛋白相互作用数据库中具有独立的调控网络。PgINO、BEL1、KAN、ANT、SPL和SUP协调调节胚芽发育，PgCRC、AG和SHP蛋白协同调控心皮的分化。

3.6位于YABBY基因启动子中的顺式作用元件

●PgCRC,PgYAB1包含生长素响应元件(TGA-motif)

●PgYAB1、PgINO、PgCRC、PgYAB5、PgYAB3冷胁迫响应元件LTR

●PgYAB1,PgYAB3,PgCRCandPgINO茉莉酸甲酯反应元件(CGTCA-motif)

●PgYAB1、PgYAB2、PgYAB3调控生长素反应元件（AuxRR-core）

●PgCRC含有赤霉素响应元件(GARE-motifandP-box).

●PgYAB5具有水杨酸反应元件(TCAmotif)

3.7YABBY基因在不同器官中的表达模式

这可能表明它们都参与调控叶子，雄性和雌性器官的发育。PgYAB2在石榴的两性花和功能性雄性花蕾发育的早期和中期以及在叶子中表达。该基因可能与石榴花中雄性和雌性器官的分化和发育有关。PgYAB5在叶片中大量表达，表明它可能在调控叶片发育中起重要作用。

●PgCRC可能参与雌雄器官分化;PgINO在两性花和外果皮发育中后期表达。

●PgYAB3和PgYABI在雄花芽分化形成的早期表达，调控叶片、雌雄器官发育。

●PgYAB2在石榴两性花芽和雄花发育的早期和中期以及叶片中均有表达，与雌雄器官的分化发育有关。

●PgYAB5在叶片中大量表达，可能在调控叶片发育中发挥重要作用。

3.8石榴花发育过程中PgYABBY的qRT-PCR分析

图9石榴花发育过程中YABBY家族基因的实时荧光定量表达分析。白色柱形代表两性花花的相对表达；黑柱表示功能性雄花的相对表达。

●PgYAB1和PgYAB3的表达水平在花蕾早期显著下降，花期后期表达水平最低。

●两性花（whitebar）中PgYAB5和PgCRC的mRNA水平高于功能雄花。

●在石榴功能雄花中，PYAB5转录水平在P2-P8期间似乎没有明显变化。

●PgINO在花蕾早期表达上升，在两性花中的mRNA水平高于功能雄花。

讨论

根据已发布的石榴转录组数据，PgYABBY在根和果皮中的表达极低。作为一个INO的直系同源物，PgINO在花中特异性表达。AtYAB3和AtYAB5，PgYAB3和PgYAB5在叶片中高表达。的观察到同一亚科中的PgYAB1和PgYAB3显示相似的表达方式，表明它们表现相似职能。PgYAB5在营养组织中表达，而PgCRC表达在花中受到限制。PgINO，PgCRC和PgYAB5是如拟南芥中报道的那样表达。这些结果初步提供了PgYABBYs与石榴花和果实的发育。qRT-PCR的结果结果表明PgYABBYs在两种类型的花比较相似。有趣的是，PgINO是在开发过程中大大高于其他成员花，在两性花中的表达也显着高于功能性雄花。证据表明INO与胚珠原基的极性有关，外表皮INO对于胚珠外被膜的形成和不对称生长拟南芥。我们推测PgINO可能是调控的关键基因石榴胚珠的分化和发育。

结论

在这项研究中，在石榴中鉴定了六个YABBY基因。通过对基因结构，功能和进化的系统分析，对PgYABBY基因进行了计算和实验表征。本研究结果说明了PgYABBYs在花发育过程中的动态转录模式，表明PgINO可能参与石榴中花器官的分化。

心得

蛋白质-蛋白质相互作用网络由单独蛋白通过彼此之间的相互作用构成，系统分析大量蛋白在生物系统中的相互作用关系，可以进一步了解生物系统中蛋白质的工作原理，学会了如何制作这个图及其描述分析。

Reference:

YujieZhao,CuiyuLiu,DapengGe,MingYan,YuanRen,XianbinHuang,ZhaoheYuan.Genome-wideidentificationandexpressionofYABBYgenesfamilyduringflowerdevelopmentinPunicagranatumL.[J].Gene,,.

本期文本

林业20级硕士：高钰涵

审定人：赵国春

编　辑：郑玉琳