刘东红，女，教授，博士，主要从事食品装备与智能制造方面的研究。

石榴(PunicagrantumL.)是一种广受喜爱的水果，其栽种面积和产量每年都在上升。石榴可直接食用，也可以被加工成果汁、饮料、果冻、调味剂和着色剂等工业产品[1]。在食品工业生产中，会有大量石榴皮产生，这些石榴皮常被当做废弃物丢弃，然而，石榴皮含有丰富的多酚，可作为多酚来源。多酚是一种次级代谢产物，能够在很多方面发挥效用，比如抗炎[2]、抗心血管疾病[3]和抗癌[4]等。从石榴皮中提取多酚能够有效利用这些工业副产物，使其得到最大化利用。

传统溶剂提取法如浸渍法等因其成熟、易于放大和易操作等优点广泛用于各种活性成分的提取，但传统方法浪费时间和能量，并且提取率较低[5]；非热加工技术，如超声辅助提取技术，能够很大限度地减少提取时间和能量的浪费。一般认为，超声辅助提取的机理涉及复杂的超声空化作用[6-7]。超声在溶液中产生空化泡，空化泡的迅速产生和破裂会产生强有力的冲击波和二次效应，如局部高温高压等[7-8]，从而对周围植物组织和细胞产生破坏，加速溶剂和细胞内溶液的对流和溶质的交换，提高提取效率。研究发现，利用超声辅助提取法从石榴皮中提取多酚，比传统溶剂法的提取时间缩短了90%，而得率提高了24%[8]，表明超声辅助提取的效率非常高；但是，不同溶剂对超声提取效果的影响和不同处理方法下多酚成分的变化尚缺乏深入研究。本研究拟采用超声辅助提取法从石榴皮中提取多酚，并与传统方法进行对比，用普鲁士蓝法测定超声处理在不同溶剂(水、正己烷、乙醇、甲醇、乙醚和乙酸乙酯)中的多酚提取效果，同时对提取参数(液固比、超声功率和超声时间)进行优化；此外，本研究还将对不同处理条件下的石榴皮多酚的成分及含量进行分析，用显微观察研究超声对植物组织表面的破坏作用。

1.1材料与试剂

石榴皮购自安徽亳州康美中药城中药材商店，为完整的大块石榴皮。将石榴皮在烘箱中干燥24h，再经粉碎后过10目和20目筛，得到粒径为10～20目的原料，室温下避光保存在玻璃干燥皿中。甲醇、甲酸均为色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司；蒸馏水，杭州娃哈哈公司；正己烷、乙醇、甲醇、乙醚、乙酸乙酯(均为分析纯)，氯化铁、铁氰化钾和盐酸，中国国药集团；没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、鞣花酸、石榴皮鞣素和安石榴苷，分析对照标准品(纯度≥98%),成都德思特生物技术有限公司。

1.2仪器与设备

JY92-IIDN型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；HH-10型数显恒温搅拌水浴锅，金坛市科杰仪器厂；UV-型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司;高效液相色谱系统(e,配有可变波长紫外检测器和Empower3色谱工作站)，美国Waters公司；XDB-C18型色谱柱(4.6mm×mm，5μm)，美国安捷伦公司；UB-i型显微镜，重庆UOP光电技术有限公司。

1.3实验方法

1.3.1传统溶剂法提取石榴皮多酚

称量0.5g石榴皮，置于超声管中，加入30mL水，在温度60℃和搅拌速度r/min条件下，水浴锅中恒温水浴60min，然后经离心过滤得到上清液，测定多酚得率。

1.3.2超声辅助提取的溶剂筛选

为了筛选出超声辅助提取的最佳溶剂，测试了6种不同溶剂下的多酚得率，包括水、正己烷、乙醇、甲醇、乙醚和乙酸乙酯。称取0.5g石榴皮，置于超声玻璃管中，加入20mL溶剂，在W下超声20min，测定多酚得率。

1.3.3超声辅助提取石榴皮多酚

采用单因素实验优化超声辅助提取多酚的相关参数，包括超声功率、超声时间和液固比。称取0.5g石榴皮，置于超声玻璃管中，按照液固比(mL∶g)为20∶1、40∶1、60∶1和80∶1，用量筒分别量取相应体积蒸馏水加入管中。在一定功率下(、、、W)，超声一定时间(5、15、25、35min)，处理后的溶液经离心过滤得到上清液，测定多酚得率。

1.3.4石榴皮多酚成分及含量测定

采用高效液相色谱法(HPLC)测定石榴皮多酚成分及含量。用注射器吸取样品1mL，在0.45μm滤膜过滤后注射到色谱瓶中，得到色谱样品备用。HPLC色谱条件：流动相A为体积分数2%的甲酸水溶液，流动相B为纯甲醇，其他条件为注射体积10μL，洗脱流速0.7mL/min，温度30℃和吸收波长nm。根据标准品曲线计算多酚各成分的含量。

1.3.5显微观察

将未处理或处理后的石榴皮冻干48h，得到冻干样品。样品放置在载玻片上，显微镜倍数为40倍，分辨率为×0，显微镜连接电脑，并设置相应参数使画面尽可能接近真实且清晰。

1.3.6总多酚得率的测定

采用普鲁士蓝法[9]测定总多酚的含量，稍有改动。取样品液10μL，加入10mL试管中，依次加入0.5mL0.1mol/LFeCl3、0.5mL0.mol/LK3Fe(CN)3溶液和0.5mL0.1mol/LHCl溶液，再加入蒸馏水至10mL，混匀后室温下避光放置15min，然后用分光光度计测定nm处吸光值。配置浓度梯度为0.2、0.6、1.0、1.6mg/mL的没食子酸标准溶液，按照以上测定方法绘制标准曲线(y=0.x-0.,R2=0.,y为吸光值，x为没食子酸浓度)。多酚得率(以没食子酸为标准)，mg/g；用式(1)计算。

多酚得率

(1)

式(1)中：A为吸光度；V为溶液体积，mL；m为石榴皮干质量，g。

2.1超声环境下不同溶剂对石榴皮多酚得率的影响

本研究对比了6种不同的溶剂对石榴皮多酚提取效果的影响，结果如图1。由图1可见，在超声环境下，石榴皮多酚在水中的溶解度最大，达到31.80mg/g,远高于其他溶剂中多酚的得率。甲醇和乙醇中的多酚得率分别为19.43mg/g和12.52mg/g，而正己烷、乙醚和乙酸乙酯中的多酚得率较低，均在4mg/g左右。实际上，石榴皮多酚在很多有机溶剂中的溶解度比水中高。王晓瑜等[10]用传统溶剂法研究了采用不同溶剂从石榴皮中提取多酚，发现多酚得率从大到小为：甲醇、乙醇、水、乙酸乙酯，与本研究结果显著不同，这和提取方法有关。超声在不同溶剂中的能量释放能力，即产生空化泡和二次现象如自由基等的能力，可能存在巨大的差异，使得超声对石榴皮组织的破坏作用和促进石榴皮多酚的释放程度存在明显的不同，从而导致这样的差异。所以，不管从多酚得率，还是安全性和环境友好型溶剂方面考虑，本研究选水作为溶剂进行后续实验研究。

图1超声环境下不同溶剂对多酚得率的影响

2.2超声辅助条件对石榴皮多酚得率的影响

2.2.1液固比对石榴皮多酚得率的影响

在超声功率为W，超声时间为25min的条件下，分别研究了液固比为20∶1、40∶1、60∶1和80∶1时的多酚得率，结果如图2。图2表明，多酚得率会随着液固比的增加而增加，当液固比从20∶1增加到60∶1，多酚得率从28.56mg/g增加到39.30mg/g。溶剂的量增加会使得细胞内外多酚浓度差变大，并且平衡会向胞外溶液倾斜而使得溶液浓度增大[11]；然而继续增加液固比，多酚得率并没有明显增加，所以60∶1是在此超声条件下的最佳液固比。

图2液固比对多酚得率的影响

2.2.2超声功率对石榴皮多酚得率的影响

在液固比为60∶1，超声时间为25min的条件下，分别对超声功率为、、、W的多酚得率进行研究，结果如图3。由图3发现，随着超声功率的提高(～W)，多酚得率逐渐升高，这是因为，更大的超声功率意味着更大的能量输入，产生更强有力的超声空化效应，导致植物组织的进一步破坏，从而释放更多的多酚[12]。在本研究中，多酚得率在超声功率W时达到最大，在W时，多酚得率变化不显著；因此W为最佳条件。

图3超声功率对多酚得率的影响

2.2.3超声时间对石榴皮多酚得率的影响

在液固比为60∶1，超声功率为W的条件下，分别对超声时间5、15、25、35min的多酚得率进行了研究，结果如图4。超声时间对石榴皮多酚得率是一个积极影响[13]，当超声时间从5min到35min时，多酚得率一直在增加。不过，在时间达到一定程度后，多酚的增加并不明显。所以考虑到时间与能量消耗，将25min作为实验最佳条件。

图4超声时间对多酚得率的影响

经过单因素实验优化，得到超声提取石榴皮多酚的优化条件为液固比60∶1、超声功率W和超声时间25min，最佳多酚得率为39.30mg/g，高于传统溶剂提取结果(32.58mg/g)，并且时间由60min减少到25min。

2.3石榴皮多酚成分分析

用HPLC测定石榴皮多酚的成分和实际含量，结果如表1。石榴皮多酚主要由没食子酸、香豆酸、绿原酸、鞣花酸、石榴皮鞣素和安石榴苷组成。从表1可以知道，安石榴苷含量最高，其次是石榴皮鞣素和没食子酸，再次是鞣花酸，而咖啡酸和丁香酸含量较低。实际上，石榴皮多酚的成分和许多因素有关，比如环境温度、季节和成熟度等；不过，文献研究[14-15]均指出，石榴皮多酚中安石榴苷、石榴皮鞣素、没食子酸和鞣花酸等的含量最高，这和本研究的结论一致。此外，通过超声处理，各成分的含量有较大的提高，这是由于超声处理加速了胞内物质的溶出。比如，安石榴苷和石榴皮鞣素分别从39.40mg/g和12.06mg/g提高到了47.80mg/g和15.10mg/g。

表1石榴皮多酚主要成分

2.4超声处理后石榴皮表面结构的表征

超声会对植物组织和细胞造成破坏[16]，因此，本研究用显微镜观察石榴皮表面的形态，分析超声对植物组织是否存在破坏作用。显微观察结果如图5。图5(a)是未处理组，图5(b)是传统溶剂法处理组，图5(c)是超声法处理组。结果表明：图5(a)和5(b)中的石榴皮表面结构完整、组织紧密，即传统溶剂法并不能明显破坏植物组织表面，因此其提取率可能更依赖于渗透作用；而图5(c)中的表面结构存在大量孔隙，表面组织不完整，表明超声能够破坏植物表面形态，所以超声可以解构植物组织，促进多酚的溶出。

白色箭头处为主要破坏处

图5不同处理条件下的石榴皮表面形态

超声辅助提取石榴皮多酚可以使石榴皮重新得到利用，发挥其最大价值。本研究利用超声辅助提取方法从石榴皮中提取多酚。在超声环境下，以不同溶剂提取多酚，发现用水作为溶剂比其他5种有机溶剂(正己烷、乙醇、甲醇、乙醚、乙酸乙酯)的提取效果更好，因此，选取水作为提取溶剂。经过单因素实验优化，得到超声辅助提取石榴皮多酚的优化条件为液固比(mL∶g)60∶1、超声功率W和超声时间25min，最佳多酚得率为39.30mg/g，高于传统溶剂提取效果(32.58mg/g)。HPLC分析表明，石榴皮多酚主要含有安石榴苷、石榴皮鞣素、没食子酸和鞣花酸。在超声处理后，石榴皮多酚各成分的含量有了较大提高。显微观察结果表明，石榴皮在超声环境下会被破坏，从而加速了多酚的提取。相比于传统溶剂法提取石榴皮多酚，超声辅助提取耗时短、得率高、更高效，因此，超声辅助提取可以提高石榴皮多酚的产量并降低提取时间。希望本研究可以为食品工业中石榴皮的高值化利用提供理论参考。

参考文献：（略）

引用格式：邓永，刘东红.超声处理对石榴皮多酚提取效果的影响[J].食品科学技术学报，,39(1):65-69.

DENGYong,LIUDonghong.Effectsofultrasoundtreatmentonextractionofpomegranatepeelpolyphenols[J].JournalofFoodScienceandTechnology,,39(1):65-69.

基金项目：国家重点研发计划项目(YFD0301);浙江省重点研究发展计划项目(C)。